TOPO Cloning Protocolos

clonación TOPO es un proceso de clonación que utiliza , en general, 3 ' residuos que son termodinámicamente inestables y los combina con una ADN polimerasa Taq . Además, el proceso utiliza un producto de reacción en cadena de polimerasa fresca ( PCR) que deben ser almacenados a 4 grados Celsius. Esta forma de clonación optimiza la topoisomerasa I molécula activa añade al final de un vector lineal. Para llevar a cabo la clonación TOPO , un determinado protocolo debe ser seguido . Preparación

Algunos pasos básicos se pueden tomar para acelerar el proceso general de clonación TOPO y ayudar a asegurar su éxito . En primer lugar, los tubos de células viables deben ser colocados en hielo para mantener su aceptabilidad. A continuación, el super cultura óptimo ( SOC ) medio, el crecimiento bacteriano enriquecido con nutrientes , debe estar a temperatura ambiente. Las placas selectivas deberían entonces ser pre - calentado a 37 grados centígrados por lo que son plenamente listo cuando llegue el momento de usarlos.
Combinando ingredientes

Para comenzar la clonación proceso , una combinación de 2 microlitros de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR ) de productos, 0,5 microlitros de solución de sal , y 0,5 microlitros de vector de clonación se debe combinar en un tubo de centrífuga de 0,5 mililitros . Una vez combinados , habrá que establecer a temperatura ambiente y se dejó incubar durante cinco a diez minutos estos ingredientes . A continuación, se añaden los ingredientes se combinaron para " Top- 10 células químicamente competentes" en un tubo de 50 microlitros y se colocan en hielo durante otros diez minutos. Después de esto, las células deben ser impactados por calor 42 grados Celsius y se colocan exactamente en hielo durante un minuto adicional antes de añadir 180 microlitros de medio SOC. Esta mezcla debe agitarse en una dirección horizontal a 200 rpm durante una hora adicional a 37 grados Celsius.
Pasos Finales

Una mezcla de 50 microlitros y 100 microlitros de cada reacción deben sembraron " en LB + AMP placas + X - Gal e incubar sin agitar durante la noche a 37 C. " Al día siguiente, las tres colonias blancas de cada reacción debe ser recogido y se coloca en 4 ml de LB + AMP y se deja incubar durante la noche a una temperatura de 37 grados centígrados con agitación a 200 rpm . El paso final es la mini - preparación de los plásmidos y esperando a ver si el proceso se ha realizado correctamente .