Cómo configurar un experimento Independiente Patch -Clamp

El experimento de patch-clamp se utiliza para medir las células vivas individuales . Lo hace con una pipeta muy fina anónima cerrada en contra de la membrana de la célula ( la cubierta protectora externa ) . La apertura de esta pipeta es sólo alrededor de 1 micrón ( una milésima parte de un milímetro ) y se controla ópticamente con un microscopio . Las células se mantiene uniforme en un plato usando un separador celular, tal como tripsina . Una célula específica se elige y la punta de la pipeta se coloca en la membrana celular. Un sello hermético se forma mediante aspiración y parte de la membrana se introduce en los pipette.Things que necesitará placa celular
tampón fosfato salino o PBS ( sin calcio y magnesio )
tripsina
Incubadora Página 10 mililitros pipeta
HEK ( keratinocyctes epidérmicos humanos ) medio
suero fetal de ternero ( FCS )
Centrífuga
solución de grabación externo
Patch viruta pinza
tapa torcedura
Electrodo de
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obtener una placa de células . Lavar la placa dos veces con 10 mililitros de PBS ( solución salina tamponada con fosfato ) sin calcio y magnesio. Añadir 2 ml de separador ( tripsina ) . Incubar la placa durante tres minutos a 37 grados Celsius. Observar la placa bajo el microscopio para asegurar que las células se han desprendido . Mover suavemente la placa para separar todas las células de la parte inferior de la placa. Añadir 10 ml de HEK ( keratinocyctes epidérmico humano ) y FCS (suero de vaca fetal) medio. Utilice una pipeta de 10 mililitros para mover las celdas hacia arriba y hacia abajo.
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Observe las células bajo el microscopio para asegurarse de que son las células individuales . Pipeta utilizando la pipeta 10 mililitros hasta que las células individuales, si es necesario. Centrifugar las células durante dos minutos a 1.000 revoluciones por minuto . Eliminar el sobrenadante . Colocar las células en 10 mililitros de suero de ternera fetal . Centrifugar las células de nuevo durante dos minutos a 1.000 revoluciones por minuto . Eliminar el sobrenadante . Colocar las células en 200 microlitros de solución de grabación externo. Observar las células bajo el microscopio en busca de células individuales con una membrana lisa .
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Coloque la solución salina dentro de un chip de patch clamp . Añadir una gota de solución de electrolito intracelular a la parte inferior del chip utilizando una pipeta . Montar el chip en una tapa de rosca . El tapón de torsión debe contener el electrodo de referencia y la línea de succión . Añadir una gota de solución de electrolito extracelular a la parte superior del chip utilizando una pipeta . La solución de electrolito permite el chip para hacer contacto con el electrodo. Añadir 5 microlitros de suspensión celular a la solución salina en el chip. Coloque una sola célula mediante succión a través de una pipeta . De succión se puede realizar manualmente mediante la succión de aire a través de la pipeta. Colocación de la resistencia a aumentos de las células para formar un sello . El sello posibilite la investigación de la célula entera .